本篇文章給大家談?wù)剬游鲋苣z模具，以及層析柱使用方法對應(yīng)的知識點，希望對各位有所幫助。

如何消除非蛋白質(zhì)的含N物質(zhì)的影響

下面的實驗五可以：其余的可能對你也有用，遂沒刪

實驗一多酚氧化酶（PPO）的分離提取

一、原理與目的

多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質(zhì)對微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會提高。多酚氧化酶也可與細胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。

PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導(dǎo)致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標之一。

本實驗將采用馬鈴薯為主要材料，通過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。

通過本項實驗，學(xué)習(xí)和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)儀器設(shè)備的操作使用，以及蛋白質(zhì)的提取、分離的系統(tǒng)技術(shù)。

二、材料與試劑

（1）馬鈴薯（大約每小組100-200g）

（2）試劑：

0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時配10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置時配

（3）實驗器械與儀器設(shè)備：

試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；

過濾紗布；植物組織勻漿器；pH計和pH試紙；GL-20C高速冷凍離心機；

DL-7A大容量低速冷凍離心機

三、操作步驟

1：粗酶提?。?/p>

水果肉組織按1：1（W/V）比例與003M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層后紗布過濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。

2：鹽析分級沉淀：

在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達到40%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），然后6000rpm離心20min棄除沉淀；離心上清液在加入固體硫酸銨達到70%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉淀。

四、實驗結(jié)果

獲得PPO粗酶液。

實驗二 PPO粗酶液的純化

一、原理

1.葡聚糖凝膠Sephadex G-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部最先流出柱外，而小分子物質(zhì)進入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)）

2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因為PPO是帶有陽離子的蛋白質(zhì)，在層析時會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫PPO，（NaCl為強離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到純化。

二、材料與試劑

試劑：0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4(內(nèi)含0.001M EDTA)配制時配10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠Sephadex G-200;蘭葡萄糖－40、70、100等；

實驗器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測儀、GL-20C高速冷凍離心機、DL-7A大容量低速冷凍離心機

三、操作步驟

1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡

（1）柱材處理

稱取一定量的Sephadex G-200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。

（2）裝柱

將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產(chǎn)生氣泡，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測儀，待層析柱的平衡。

（3）平衡

在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝膠。

2．上樣：將粗酶液上柱。

3．洗脫：用0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測定。

4．DEAE－纖維素的處理及裝柱

（1）處理

本實驗采用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。

（2）裝柱

將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測儀，待層析柱的平衡。

（3）平衡

在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M EDTA)，預(yù)先將DE-52柱進行平衡。

5．上樣：

將洗脫酶液上樣，用0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫雜蛋白。

6．洗脫：

用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4(內(nèi)含0.001M EDTA)進行梯度洗脫。

7．測定酶活性和蛋白質(zhì)濃度

實驗三 PPO活性測定

一、原理與方法

PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實驗是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410nm處使反應(yīng)體系的OD值產(chǎn)生變化，通過OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO的酶活大小。

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05ml酶液，反應(yīng)5分鐘，在分光光度計410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01O.D.值定義為一個酶活性單位（U）。

二、儀器與試劑

（1）樣品：

多酚氧化酶粗酶液

硫酸銨沉淀組分

DE-52洗脫組分

葡聚糖凝膠洗脫組分

（2）底物：

鄰苯二酚：O.01M鄰苯二酚溶液

（3）反應(yīng)體系：

0.2M鄰酸二氫鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8

（4）器皿與儀器：

試管、恒溫水浴等

分光光度計

三、酶蛋白的比活性

比活性＝酶活單位（U）/mg蛋白質(zhì)

四、實驗結(jié)果與分析

1. Sephadex G-200的洗脫組分的相對濃度（OD590）和相對酶活（OD410）

結(jié)果列表

試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.16 0.09

粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

分析:2和3試管中含絕大部分所需蛋白,保存進行下一步純化。

2. DE-52的洗脫組分的相對濃度（OD590）和相對酶活（OD410）

結(jié)果列表

試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.03 0.05

粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

分析:酶活性高低不一定與蛋白含量高低成正比,3和4試管中含較多所需蛋白。

實驗四胰酶分離提取

一、原理與目的

提取制備酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，最后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結(jié)晶。

胰酶在PH3.0時最穩(wěn)定，可在低溫下儲存較長的時間而不失活；低與此PH酶易變性；高于PH5時，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程應(yīng)在低溫和低PH下進行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理條件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環(huán)化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約24000－25000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過程中，酶原N端Lys與Ile之間的一個肽鏈被斷裂，丟失一個6肽，分子構(gòu)象發(fā)生改變，PI變成10.8。

本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時為親和層析、免疫學(xué)實驗準備實驗樣品。

二、材料與試劑

1．儀器

紫外光分光光度計、恒溫水浴、離心機、組織搗碎機、PH計、顯微鏡、秒表、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。

2．材料：新鮮豬胰臟

3．試劑及溶液配制

pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。

0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合后用PH計校正。

三、操作步驟

1．胰蛋白酶原的提取與分離：

（1）稱取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，在低溫下用絞肉機絞碎胰臟（或用高速組織勻漿機搗碎）加1－2倍體積以預(yù)冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提?。ò?g組織相當于1ml體積計算，以此類推）。檢查提取液中PH，若高于PH3.0時應(yīng)及時用10％乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而后用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘渣一次（時間約為1－2h），合并濾液，此時濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調(diào)整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。

(2)鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用4000r/min離心機離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱重，可得約20g胰蛋白酶原粗制品。

（3）胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用于測定，溶液中硫酸銨得含量（約為濾餅重得1/4）。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結(jié)合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計算，將已研細的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調(diào)PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結(jié)晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。

（4）純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約1000ml，加入已經(jīng)研細的硫酸銨粉末，使其溶液達40％飽和度（每升濾液加242g硫酸銨）。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉淀。

實驗五卵清蛋白分離提取

一、實驗?zāi)康呐c原理

雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比為1:1。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都是相當穩(wěn)定的，而在堿性溶液中較不穩(wěn)定。

由于雞卵粘蛋白對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，因此可以用雞卵粘蛋白做親和配基配制純化胰酶的親和材料。

二、材料與試劑：

1．材料：新鮮雞蛋2只

2：儀器：抽濾瓶500－1000ml、燒結(jié)漏斗、移液器、磁力攪拌器

3：試劑：

10％TCA，用固體NaOH調(diào)調(diào)PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml

pH8.0,0.1M Tris-HCL緩沖液

三、操作步驟

1，取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50ml，置于燒杯中，外用溫水浴25℃－30℃，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，加完后最終PH約3.5，再繼續(xù)攪拌30min，然后在4℃冰箱中放置過夜。

2,次日用布氏漏斗抽濾，得黃綠色清液。

3，邊攪拌邊加入4℃預(yù)冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后將上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm離心5min，收集沉淀。

4，將沉淀溶于10ml無離子水中，對無離子水（50倍）透析4h，換水兩次，再對碳酸鈉緩沖液透析過夜，4000rpm離心10min ,去除不溶物。

實驗六親和層析純化胰酶

一、實驗?zāi)康呐c原理

生物大分子化合物的重要特征之一是具有與某些相對應(yīng)的分子通過次級鍵或共價鍵專一結(jié)合的能力即親和力。例如酶與抑制劑之間，抗原與抗體之間，結(jié)合的雙方不僅是專一的，而且結(jié)合以后可以在不喪失生物活性的基礎(chǔ)上用物理或化學(xué)的方法進行解離。根據(jù)這一特性，如果把具有親和力的一對分子的某一方連接于水不溶的固體載體上作為固定相，那么另一方隨著流動相流經(jīng)該固定相的時候，雙方便親和結(jié)合為一個整體。然后只有改變某種物理條件或化學(xué)條件使結(jié)合的雙方解離，即能得到于固定相有特異親和力的某一特定物質(zhì)。這種利用生物分子和相對應(yīng)分子之間親和結(jié)合和解離性質(zhì)而建立起來的層析方法稱之為親和層析。

本實驗通過將胰蛋白酶抑制劑－雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過程和技術(shù)。

二、儀器與試劑

1.雞卵粘蛋白制備

2．Sephadex-G75的活化和偶聯(lián)

2．5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、純化的雞卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水）

3．親和層析

0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶約50ml 、0.1N甲酸鉀、0.5M KCL pH2.5 100ml

儀器器材：抽濾瓶500－1000ml、層析柱、紫外分光光度計、紫外蛋白檢測儀、燒杯漏斗、移液管、磁力攪拌器

三、操作步驟

1、雞卵粘蛋白的制備

2、Sephadex-G75的活化及偶聯(lián)

2.5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75溶脹洗滌數(shù)次，緩慢攪拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸餾水洗滌數(shù)次，抽干備用，活化凝膠，純化的雞卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝膠，75％K2CO3，調(diào)pH7.5-9.0,緩慢攪拌3h。反應(yīng)過程隨時加入5％K2CO3,以維持pH的穩(wěn)定。0.27gKBH4 溶于20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應(yīng)5h，pH維持在6.5-7.5，洗滌。

3、胰蛋白酶的親和層析

卵類粘蛋白在pH7－8的條件下能與胰蛋白酶專一地結(jié)合，而在pH2－3時又能解離，因而掌握好上柱地PH條件和洗脫緩沖條件，便可將胰蛋白酶從含雜蛋白地粗酶液中選擇性地結(jié)合于柱上，待洗去不結(jié)合或非專一性結(jié)合地雜蛋白后，改變PH值便可將胰蛋白酶洗脫下來。從而達到純化地目的。由于親和層析結(jié)合地專一性，上柱體積可以比較大，得到濃縮的提純產(chǎn)品。

(1)親和層析

將雞卵粘蛋白－Sephadex-G75裝柱（110cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的緩沖液平衡，平衡約2－3倍的柱體積。將粗胰酶液上柱層析。用紫外蛋白監(jiān)測儀280nm處檢測蛋白質(zhì)吸收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達到穩(wěn)定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過柱的負荷時，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時應(yīng)停止樣品上樣，改用pH7.5的平衡緩沖液沖洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線后，改用0.1N的甲酸鉀0.5M KCL,Ph2.5的洗脫液解析，柱的流速維持在1.5ml/min左右，收集洗脫下來的蛋白峰蛋白，測總蛋白量及比活性，并根據(jù)上柱樣品的總蛋白量和比活性計算經(jīng)親和層析后胰蛋白酶比活性提高的倍數(shù)，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。

當胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線后，重新用緩沖液平衡，親和層析柱可以反復(fù)使用。

（2）胰酶蛋白和活性測定

實驗七 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量及蛋白質(zhì)的純度鑒定

一、實驗?zāi)康呐c原理

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS),大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，即每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS－復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)與電泳遷移率間呈負相關(guān)。

本實驗的目的是對多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測定，通過實驗，學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。

二、儀器與試劑

1．材料：

硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。

2．試劑：

（1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis）

（2）10％的SDS溶液

（3）10％的過硫酸銨溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris,PH8.8

（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris,PH6.8

（7）電極緩沖液：1030g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3

（8）樣品緩沖液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭

（9）染色液：0.15％考馬斯亮藍R250，溶于脫色液

（10）脫色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液

（11）標準分子量蛋白。

3．儀器設(shè)備：

電泳儀，垂直電泳槽等。

三、操作步驟

1, 凝膠制備：

用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配制好的分離膠溶液，倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集后，倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。

2, 上樣：

分別取樣品若干ml于離心管中，按1/1-1/5比例加入5樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3－5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過30ul不同濃度的標準蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA（2－3mA/em），保持電流穩(wěn)定不變，當溴酚藍遷移到離分離膠底1－2cm時，即可停止電泳。

3, 染色：

電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

四、結(jié)果 （略）

五、注意事項

1、 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），如果比例不當，就不能得到準確的數(shù)據(jù)。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線。不能利用這次的標準曲線作為下次用。

3、有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。

4、有的蛋白質(zhì)（如：電荷異常或結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。

5、如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。

等電聚焦電泳（IEF）分離蛋白及測定蛋白質(zhì)等電點

一、原理

等電點聚焦（IEF）是在電場中分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個重要發(fā)展，等電聚焦是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。

在電場中充有兩性載體和抗對流介質(zhì)，當加上電場后，由于兩性載體移動的結(jié)果，在兩極間逐步建立穩(wěn)定的pH梯度，當?shù)鞍踪|(zhì)分子或其他兩性分子存在于這樣的pH梯度中時，這種分子便會由于其表面電荷在此電場中運動，并最終達到一個使其表面靜電荷為0的區(qū)帶，這時的pH則是該分子的pI，聚焦在等電點的分子也會不斷擴散，一旦偏離其等電點后，由于pH環(huán)境的改變，分子又立即得到正電荷或負電荷，從而又向pI遷移。因此，這些分子總會是處于不斷擴散和抗擴散的平衡中，在pI處得以“聚焦”.

二、儀器與試劑

1．材料：蛋白樣品

2．試劑：

聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、兩性電解質(zhì)、尿素、NP-40、teiton-100

電極液：1M磷酸（陽極液）、1M氫氧化鈉（陰極液）

固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水楊酸溶于500ml，定容為1000ml

染色液：0.35g考馬斯亮藍R－150溶于300ml脫色液中，加熱到60－70℃，加入0.3g硫酸銅。

脫色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水

樣品緩沖液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素

三、操作步驟：

1, 樣品制備：

用IEF樣品緩沖液提取待分析樣品，如其他緩沖液提取的樣品則應(yīng)透析后，冷凍干燥、再復(fù)溶于IEF樣品緩沖液。充分溶解后，離心去除不溶雜質(zhì)。

2,制模具：

洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進行硅化和反硅化處理，兩塊玻璃板的硅化和反硅化面相對，放上夾條，夾子夾好。

3, 配膠：

膠液組成：6ml膠母液（10％，19/1）

6－8％尿素

1ml Ampholine (pH3.5-10)

60-80ul 10%AP

5 ul TEMED

4, 灌膠：配好的膠迅速灌入模具

5, 電泳：

等膠凝固后，小心揭去上下玻璃板，將塑料墊片底部擦干，小心放于電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置上放上小擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋上蓋子，橫功率25W電泳，約10min后，暫停電泳，取下紙片，繼續(xù)電泳約30min，待電流達4mA以下，停止電泳。

6, 表面電極測定蛋白質(zhì)的pI

7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min

8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現(xiàn)

9, 可脫色至背景消除后干燥保存。

四、結(jié)果 （略）

五、注意事項

1、兩性電解質(zhì)是等電聚焦的關(guān)鍵試劑，它的含量2％-3％較合適，能形成較好的pH梯度。

2、 丙烯酰胺最好是經(jīng)過重結(jié)晶的。

3、 過硫酸銨一定要新配置。

4、 所有水用重蒸水。

5、樣品必須無離子，否則電泳時樣品帶可能走歪，拖帶或根本不成帶。

6、 平板等電聚焦電泳的膠很薄，當電流穩(wěn)定在8mA，電壓上升到550V 以上，由于陰極飄移，造成局部電流過大，膠承受不了而被燒斷。

懸賞300分:我想做northern blot,誰幫我設(shè)計一下?

我只會做

要不傳影象給你

溶液:

(1) 轉(zhuǎn)移緩沖液：稱取2.9g甘氨酸，5.8g Tris堿，0.37 SDS，200ml甲醇，加去離子水至1000ml，如果蛋白分子量小可不加SDS。

(2) PBS－T： NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4?12H2O 2.9g, 溶于800ml去離子水中，用鹽酸調(diào)PH值為7.4，定溶至1000ml，加0.05％Tween20。

(3) 封閉液：5%脫脂奶溶于PBS中

(4) 氨基黑染液：0.2%氨基黑溶于7%乙酸中。

(5) 氨基黑脫色液：30%甲醇, 10%冰醋酸溶液

SDS-PAGE相關(guān)溶液

(1).電極緩沖液：

Tris: 6g

甘氨酸： 28.8g

(10% )SDS: 10ml

加1000 ml H2O PH:8.3

(2).分離膠buffer: 100ml:

Tris:36.6g

1N HCL:(約48ml): PH:8.9

加水至：100ml

(3). 濃縮膠buffer: 100ml:

Tris: 5.98g

1N HCL:(約48ml): PH:

加水至：100ml

(4).凝膠貯存液： 100ml:

Acr:30g

Bis:0.8g

加水至：100ml

(5). 4Xloading buffer:

2-Me: 20% 2ml

SDS: 8% 0.8g

Glycerin: 40% 4ml

Bromophenol Blue: 0.4% 0.04g

Tris-CL (ph6.8) 240mM 2.5ml(濃縮膠buffer)

加1.5ml H2O

total: 10ml

(6) 染色液(快速染色配方，染色1小時

0.1% Coomassie blue, 10% acetic acid, 45% methanol

考馬斯藍R-250 1g

甲醇 450ml

水 450ml

冰醋酸 100ml

(7). 脫色液：1000ml

冰醋酸： 75ml

甲醇： 50ml

水： 875ml

細胞裂解液

（1）Buffer A: 25 mM Tris pH 7,5

50 mM KCl

2 mM MgCl2

1 mM EDTA

5 mM dithiothreitol (DTT)

（2）細胞核裂解液

Buffer NE:

25 mM Tris pH 7,5

0.42 M NaCl

1.5 mM MgCl2

0.5 mM EDTA

1 mM dithiothreitol (DTT)

25% Sucrose

0.2% SDS (免疫沉淀不加)

裂解細胞前加入蛋白酶抑制劑至終濃度為 100 mg?L-1 PMSF, 1 mg?L-1 Aprotinin, 2 mg?L-1 Leupeptin

步驟:SDS-PAGE電泳

按照膠配置方法配制不同濃度PAGE膠，電泳置染料抵達分離膠底部，斷開電源。 取下凝膠，

Western Blot

1. 電泳結(jié)束后，切下帶有要轉(zhuǎn)移蛋白泳道的凝膠用，右下角作一標記以確定方向及正反面。

2. 剪1塊與凝膠大小相同的NC膜（不能大于凝膠），右下角作一標記，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，大約5分鐘。

3. 剪8塊新華1號濾紙，右下角作一標記，其大小略與凝膠相同（不能大于凝膠）。

4. 將剪好的濾紙在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡，按陽極到陰極（從下至上）順序安裝轉(zhuǎn)移裝置: 平放底部電極，在底部電極上放置4張浸泡好的濾紙,精確對齊，將NC膜放在濾紙上，排除氣泡。把SDS-PAGE 電泳凝膠轉(zhuǎn)移到去轉(zhuǎn)移緩沖液中漂洗，平放于NC膜上，用玻棒擠出所有氣泡。在其上再放置4張浸泡好的濾紙，排出氣泡。

5. 將上層電極放于夾層物上，連接電源，根據(jù)凝膠面積按1mA/cm2接通電源，電轉(zhuǎn)移2~4h。100mA,2h。

6. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，去除濾紙。把凝膠轉(zhuǎn)移到考馬斯亮藍染液的托盤中染色，以檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。剪下含分子量標準的NC膜放在氨基黑染液中染色30秒，氨基黑脫色液脫色。

7. 將轉(zhuǎn)移上蛋白的NC膜以蒸餾水略洗稍干后，浸在封閉液中4℃封閉過夜，然后用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min。

8. 將膜與第一抗體室溫孵育2h，第一抗體用PBS-T緩沖液按不同稀釋度稀釋以摸索最合適的一抗?jié)舛?，然后PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min。

9. 將膜與HRP標記的羊抗鼠IgG(1:5000)共同孵育1h，PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min。

10. 配制發(fā)光底物（按1：1混合底物液）。

11. PBS-T緩沖液洗滌后在化學(xué)發(fā)光底物顯色2分鐘，凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。（或DAB顯色液中避光顯色~15分鐘，出現(xiàn)條帶后立即以水沖洗以中斷顯色反應(yīng)）。

我只是舉個例子給你看,因為只有你自己想出來的實驗才是得心應(yīng)手的.別人手把手教你做實驗,那么你的思路就會跟著別人走,有可能被別人誤導(dǎo),那你做這個實驗又有什么意思.

怎樣去除蛋清中的雞卵類粘蛋白?

下面的實驗五可以：其余的可能對你也有用，遂沒刪

實驗一多酚氧化酶（PPO）的分離提取

一、原理與目的

多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質(zhì)對微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會提高。多酚氧化酶也可與細胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。

PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導(dǎo)致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標之一。

本實驗將采用馬鈴薯為主要材料，通過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。

通過本項實驗，學(xué)習(xí)和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)儀器設(shè)備的操作使用，以及蛋白質(zhì)的提取、分離的系統(tǒng)技術(shù)。

二、材料與試劑

（1）馬鈴薯（大約每小組100-200g）

（2）試劑：

0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時配10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置時配

（3）實驗器械與儀器設(shè)備：

試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；

過濾紗布；植物組織勻漿器；pH計和pH試紙；GL-20C高速冷凍離心機；

DL-7A大容量低速冷凍離心機

三、操作步驟

1：粗酶提?。?/p>

水果肉組織按1：1（W/V）比例與003M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層后紗布過濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。

2：鹽析分級沉淀：

在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達到40%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），然后6000rpm離心20min棄除沉淀；離心上清液在加入固體硫酸銨達到70%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉淀。

四、實驗結(jié)果

獲得PPO粗酶液。

實驗二 PPO粗酶液的純化

一、原理

1.葡聚糖凝膠Sephadex G-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部最先流出柱外，而小分子物質(zhì)進入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)）

2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因為PPO是帶有陽離子的蛋白質(zhì)，在層析時會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫PPO，（NaCl為強離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到純化。

二、材料與試劑

試劑：0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4(內(nèi)含0.001M EDTA)配制時配10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠Sephadex G-200;蘭葡萄糖－40、70、100等；

實驗器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測儀、GL-20C高速冷凍離心機、DL-7A大容量低速冷凍離心機

三、操作步驟

1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡

（1）柱材處理

稱取一定量的Sephadex G-200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。

（2）裝柱

將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產(chǎn)生氣泡，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測儀，待層析柱的平衡。

（3）平衡

在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝膠。

2．上樣：將粗酶液上柱。

3．洗脫：用0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測定。

4．DEAE－纖維素的處理及裝柱

（1）處理

本實驗采用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。

（2）裝柱

將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測儀，待層析柱的平衡。

（3）平衡

在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M EDTA)，預(yù)先將DE-52柱進行平衡。

5．上樣：

將洗脫酶液上樣，用0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫雜蛋白。

6．洗脫：

用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4(內(nèi)含0.001M EDTA)進行梯度洗脫。

7．測定酶活性和蛋白質(zhì)濃度

實驗三 PPO活性測定

一、原理與方法

PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實驗是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410nm處使反應(yīng)體系的OD值產(chǎn)生變化，通過OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO的酶活大小。

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05ml酶液，反應(yīng)5分鐘，在分光光度計410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01O.D.值定義為一個酶活性單位（U）。

二、儀器與試劑

（1）樣品：

多酚氧化酶粗酶液

硫酸銨沉淀組分

DE-52洗脫組分

葡聚糖凝膠洗脫組分

（2）底物：

鄰苯二酚：O.01M鄰苯二酚溶液

（3）反應(yīng)體系：

0.2M鄰酸二氫鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8

（4）器皿與儀器：

試管、恒溫水浴等

分光光度計

三、酶蛋白的比活性

比活性＝酶活單位（U）/mg蛋白質(zhì)

四、實驗結(jié)果與分析

1. Sephadex G-200的洗脫組分的相對濃度（OD590）和相對酶活（OD410）

結(jié)果列表

試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.16 0.09

粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

分析:2和3試管中含絕大部分所需蛋白,保存進行下一步純化。

2. DE-52的洗脫組分的相對濃度（OD590）和相對酶活（OD410）

結(jié)果列表

試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.03 0.05

粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

分析:酶活性高低不一定與蛋白含量高低成正比,3和4試管中含較多所需蛋白。

實驗四胰酶分離提取

一、原理與目的

提取制備酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，最后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結(jié)晶。

胰酶在PH3.0時最穩(wěn)定，可在低溫下儲存較長的時間而不失活；低與此PH酶易變性；高于PH5時，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程應(yīng)在低溫和低PH下進行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理條件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環(huán)化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約24000－25000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過程中，酶原N端Lys與Ile之間的一個肽鏈被斷裂，丟失一個6肽，分子構(gòu)象發(fā)生改變，PI變成10.8。

本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時為親和層析、免疫學(xué)實驗準備實驗樣品。

二、材料與試劑

1．儀器

紫外光分光光度計、恒溫水浴、離心機、組織搗碎機、PH計、顯微鏡、秒表、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。

2．材料：新鮮豬胰臟

3．試劑及溶液配制

pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。

0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合后用PH計校正。

三、操作步驟

1．胰蛋白酶原的提取與分離：

（1）稱取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，在低溫下用絞肉機絞碎胰臟（或用高速組織勻漿機搗碎）加1－2倍體積以預(yù)冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提?。ò?g組織相當于1ml體積計算，以此類推）。檢查提取液中PH，若高于PH3.0時應(yīng)及時用10％乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而后用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘渣一次（時間約為1－2h），合并濾液，此時濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調(diào)整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。

(2)鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用4000r/min離心機離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱重，可得約20g胰蛋白酶原粗制品。

（3）胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用于測定，溶液中硫酸銨得含量（約為濾餅重得1/4）。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結(jié)合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計算，將已研細的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調(diào)PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結(jié)晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。

（4）純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約1000ml，加入已經(jīng)研細的硫酸銨粉末，使其溶液達40％飽和度（每升濾液加242g硫酸銨）。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉淀。

實驗五卵清蛋白分離提取

一、實驗?zāi)康呐c原理

雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比為1:1。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都是相當穩(wěn)定的，而在堿性溶液中較不穩(wěn)定。

由于雞卵粘蛋白對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，因此可以用雞卵粘蛋白做親和配基配制純化胰酶的親和材料。

二、材料與試劑：

1．材料：新鮮雞蛋2只

2：儀器：抽濾瓶500－1000ml、燒結(jié)漏斗、移液器、磁力攪拌器

3：試劑：

10％TCA，用固體NaOH調(diào)調(diào)PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml

pH8.0,0.1M Tris-HCL緩沖液

三、操作步驟

1，取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50ml，置于燒杯中，外用溫水浴25℃－30℃，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，加完后最終PH約3.5，再繼續(xù)攪拌30min，然后在4℃冰箱中放置過夜。

2,次日用布氏漏斗抽濾，得黃綠色清液。

3，邊攪拌邊加入4℃預(yù)冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后將上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm離心5min，收集沉淀。

4，將沉淀溶于10ml無離子水中，對無離子水（50倍）透析4h，換水兩次，再對碳酸鈉緩沖液透析過夜，4000rpm離心10min ,去除不溶物。

實驗六親和層析純化胰酶

一、實驗?zāi)康呐c原理

生物大分子化合物的重要特征之一是具有與某些相對應(yīng)的分子通過次級鍵或共價鍵專一結(jié)合的能力即親和力。例如酶與抑制劑之間，抗原與抗體之間，結(jié)合的雙方不僅是專一的，而且結(jié)合以后可以在不喪失生物活性的基礎(chǔ)上用物理或化學(xué)的方法進行解離。根據(jù)這一特性，如果把具有親和力的一對分子的某一方連接于水不溶的固體載體上作為固定相，那么另一方隨著流動相流經(jīng)該固定相的時候，雙方便親和結(jié)合為一個整體。然后只有改變某種物理條件或化學(xué)條件使結(jié)合的雙方解離，即能得到于固定相有特異親和力的某一特定物質(zhì)。這種利用生物分子和相對應(yīng)分子之間親和結(jié)合和解離性質(zhì)而建立起來的層析方法稱之為親和層析。

本實驗通過將胰蛋白酶抑制劑－雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過程和技術(shù)。

二、儀器與試劑

1.雞卵粘蛋白制備

2．Sephadex-G75的活化和偶聯(lián)

2．5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、純化的雞卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水）

3．親和層析

0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶約50ml 、0.1N甲酸鉀、0.5M KCL pH2.5 100ml

儀器器材：抽濾瓶500－1000ml、層析柱、紫外分光光度計、紫外蛋白檢測儀、燒杯漏斗、移液管、磁力攪拌器

三、操作步驟

1、雞卵粘蛋白的制備

2、Sephadex-G75的活化及偶聯(lián)

2.5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75溶脹洗滌數(shù)次，緩慢攪拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸餾水洗滌數(shù)次，抽干備用，活化凝膠，純化的雞卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝膠，75％K2CO3，調(diào)pH7.5-9.0,緩慢攪拌3h。反應(yīng)過程隨時加入5％K2CO3,以維持pH的穩(wěn)定。0.27gKBH4 溶于20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應(yīng)5h，pH維持在6.5-7.5，洗滌。

3、胰蛋白酶的親和層析

卵類粘蛋白在pH7－8的條件下能與胰蛋白酶專一地結(jié)合，而在pH2－3時又能解離，因而掌握好上柱地PH條件和洗脫緩沖條件，便可將胰蛋白酶從含雜蛋白地粗酶液中選擇性地結(jié)合于柱上，待洗去不結(jié)合或非專一性結(jié)合地雜蛋白后，改變PH值便可將胰蛋白酶洗脫下來。從而達到純化地目的。由于親和層析結(jié)合地專一性，上柱體積可以比較大，得到濃縮的提純產(chǎn)品。

(1)親和層析

將雞卵粘蛋白－Sephadex-G75裝柱（110cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的緩沖液平衡，平衡約2－3倍的柱體積。將粗胰酶液上柱層析。用紫外蛋白監(jiān)測儀280nm處檢測蛋白質(zhì)吸收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達到穩(wěn)定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過柱的負荷時，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時應(yīng)停止樣品上樣，改用pH7.5的平衡緩沖液沖洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線后，改用0.1N的甲酸鉀0.5M KCL,Ph2.5的洗脫液解析，柱的流速維持在1.5ml/min左右，收集洗脫下來的蛋白峰蛋白，測總蛋白量及比活性，并根據(jù)上柱樣品的總蛋白量和比活性計算經(jīng)親和層析后胰蛋白酶比活性提高的倍數(shù)，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。

當胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線后，重新用緩沖液平衡，親和層析柱可以反復(fù)使用。

（2）胰酶蛋白和活性測定

實驗七 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量及蛋白質(zhì)的純度鑒定

一、實驗?zāi)康呐c原理

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS),大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，即每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS－復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)與電泳遷移率間呈負相關(guān)。

本實驗的目的是對多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測定，通過實驗，學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。

二、儀器與試劑

1．材料：

硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。

2．試劑：

（1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis）

（2）10％的SDS溶液

（3）10％的過硫酸銨溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris,PH8.8

（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris,PH6.8

（7）電極緩沖液：1030g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3

（8）樣品緩沖液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭

（9）染色液：0.15％考馬斯亮藍R250，溶于脫色液

（10）脫色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液

（11）標準分子量蛋白。

3．儀器設(shè)備：

電泳儀，垂直電泳槽等。

三、操作步驟

1, 凝膠制備：

用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配制好的分離膠溶液，倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集后，倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。

2, 上樣：

分別取樣品若干ml于離心管中，按1/1-1/5比例加入5樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3－5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過30ul不同濃度的標準蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA（2－3mA/em），保持電流穩(wěn)定不變，當溴酚藍遷移到離分離膠底1－2cm時，即可停止電泳。

3, 染色：

電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

四、結(jié)果 （略）

五、注意事項

1、 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），如果比例不當，就不能得到準確的數(shù)據(jù)。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線。不能利用這次的標準曲線作為下次用。

3、有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。

4、有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。

5、如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。

等電聚焦電泳（IEF）分離蛋白及測定蛋白質(zhì)等電點

一、原理

等電點聚焦（IEF）是在電場中分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個重要發(fā)展，等電聚焦是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。

在電場中充有兩性載體和抗對流介質(zhì)，當加上電場后，由于兩性載體移動的結(jié)果，在兩極間逐步建立穩(wěn)定的pH梯度，當?shù)鞍踪|(zhì)分子或其他兩性分子存在于這樣的pH梯度中時，這種分子便會由于其表面電荷在此電場中運動，并最終達到一個使其表面靜電荷為0的區(qū)帶，這時的pH則是該分子的pI，聚焦在等電點的分子也會不斷擴散，一旦偏離其等電點后，由于pH環(huán)境的改變，分子又立即得到正電荷或負電荷，從而又向pI遷移。因此，這些分子總會是處于不斷擴散和抗擴散的平衡中，在pI處得以“聚焦”.

二、儀器與試劑

1．材料：蛋白樣品

2．試劑：

聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、兩性電解質(zhì)、尿素、NP-40、teiton-100

電極液：1M磷酸（陽極液）、1M氫氧化鈉（陰極液）

固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水楊酸溶于500ml，定容為1000ml

染色液：0.35g考馬斯亮藍R－150溶于300ml脫色液中，加熱到60－70℃，加入0.3g硫酸銅。

脫色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水

樣品緩沖液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素

三、操作步驟：

1, 樣品制備：

用IEF樣品緩沖液提取待分析樣品，如其他緩沖液提取的樣品則應(yīng)透析后，冷凍干燥、再復(fù)溶于IEF樣品緩沖液。充分溶解后，離心去除不溶雜質(zhì)。

2,制模具：

洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進行硅化和反硅化處理，兩塊玻璃板的硅化和反硅化面相對，放上夾條，夾子夾好。

3, 配膠：

膠液組成：6ml膠母液（10％，19/1）

6－8％尿素

1ml Ampholine (pH3.5-10)

60-80ul 10%AP

5 ul TEMED

4, 灌膠：配好的膠迅速灌入模具

5, 電泳：

等膠凝固后，小心揭去上下玻璃板，將塑料墊片底部擦干，小心放于電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置上放上小擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋上蓋子，橫功率25W電泳，約10min后，暫停電泳，取下紙片，繼續(xù)電泳約30min，待電流達4mA以下，停止電泳。

6, 表面電極測定蛋白質(zhì)的pI

7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min

8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現(xiàn)

9, 可脫色至背景消除后干燥保存。

四、結(jié)果 （略）

五、注意事項

1、兩性電解質(zhì)是等電聚焦的關(guān)鍵試劑，它的含量2％-3％較合適，能形成較好的pH梯度。

2、 丙烯酰胺最好是經(jīng)過重結(jié)晶的。

3、 過硫酸銨一定要新配置。

4、 所有水用重蒸水。

5、樣品必須無離子，否則電泳時樣品帶可能走歪，拖帶或根本不成帶。

6、 平板等電聚焦電泳的膠很薄，當電流穩(wěn)定在8mA，電壓上升到550V 以上，由于陰極飄移，造成局部電流過大，膠承受不了而被燒斷。

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